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賽默飛 QuantStudio 5 熒光定量 PCR 儀操作規(guī)程

更新時間:2025-03-18點擊次數:121

賽默飛 QuantStudio 5 熒光定量 PCR 儀操作規(guī)程

一、目的

為確保賽默飛 QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀的正確使用,提高實驗效率,確保實驗數據的準確性和重復性,特制定本操作規(guī)程。該規(guī)程適用于分子生物學、基因表達分析、核酸檢測等相關實驗中的PCR檢測工作。

二、適用范圍

本規(guī)程適用于使用賽默飛 QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀進行核酸擴增和熒光定量檢測的實驗操作人員。適用場景包括科研實驗室、醫(yī)療檢測機構、食品和環(huán)境檢測單位等。

三、儀器簡介

QuantStudio 5 是賽默飛生命科學儀器平臺推出的一款實時熒光定量PCR設備,具備96孔與384孔兩種格式版本。該儀器配置靈敏的熒光檢測系統(tǒng)和高精度溫控模塊,配套Design and Analysis軟件進行數據處理和可視化分析,支持多種應用場景。

主要技術參數:

  • 檢測通道:最多支持6個熒光通道

  • 熒光染料兼容性:FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等

  • 樣品通量:96孔(0.2 mL)或384孔板

  • 溫控精度:±0.25℃

  • 升降溫速率:最大4.0℃/秒

  • 最小檢測體積:10 μL(推薦),5 μL為限

  • 光學系統(tǒng):獨立激發(fā)和發(fā)射濾光片,快速濾片切換

  • 軟件平臺:QuantStudio Design and Analysis 軟件

  • 數據輸出格式:Excel、PDF、CSV等

四、使用準備

1. 儀器開機檢查

  • 打開主機電源,檢查設備狀態(tài)燈是否正常(綠色為正常)

  • 確保計算機與主機通過USB或局域網連接

  • 啟動QuantStudio軟件,登錄用戶賬戶

  • 檢查樣品艙是否干凈,無液體殘留或雜質

  • 確保熒光濾光片和溫控板無損傷、無污染

2. 實驗準備

  • 準備反應體系,包括引物、探針、酶、緩沖液及模板核酸

  • 樣本混勻后加樣至PCR板或試管中,封板并輕輕離心去除氣泡

  • 樣本總量建議控制在10–20 μL,確保PCR反應效率

  • 使用推薦的光學透明封板膜,避免熒光信號干擾

3. 模板與耗材管理

  • 使用專用PCR板(0.2 mL)和光學封板膜

  • 樣本添加順序應按照軟件設定模板進行,確保板位與樣本對應

  • 樣品編號應統(tǒng)一命名,便于后續(xù)分析追蹤

  • 若實驗涉及多個通道檢測,確保熒光染料無交叉干擾

五、操作流程

1. 實驗設置

  • 打開軟件,點擊“新建實驗"

  • 選擇實驗類型(定量PCR、熔解曲線分析、相對定量等)

  • 選擇熒光染料和檢測通道,匹配實驗方案

  • 設定PCR擴增程序,如:

    • 95℃ 15秒

    • 60℃ 60秒(熒光采集)

    • 初始變性:95℃ 10分鐘

    • 擴增循環(huán)(40 cycles):

  • 設定板圖:將樣本、陰性對照、陽性對照、標準品標注至對應孔位

  • 保存方法模板文件,便于重復使用

2. 加載樣品與運行

  • 打開儀器樣品艙,將96孔PCR板平穩(wěn)放置在加熱模塊上

  • 關閉樣品艙蓋,確保均勻受熱

  • 點擊“開始運行"按鈕,系統(tǒng)將執(zhí)行程序并實時采集數據

  • 實驗過程中可查看擴增曲線,監(jiān)測熒光信號變化

3. 實驗完成與數據分析

  • 實驗結束后,系統(tǒng)自動生成Ct值表格和擴增圖

  • 可進行標準曲線分析、基因表達比值計算、熔解曲線分析等

  • 可導出數據報告,包括Ct值、擴增效率、圖表等格式

  • 根據需求保存為PDF、Excel或圖像文件,進行后續(xù)統(tǒng)計分析

4. 實驗結束后的處理

  • 移除PCR板并按廢物處理流程處置

  • 用干凈棉簽或無塵紙巾清潔加熱模塊表面

  • 關閉軟件與主機,切斷電源,蓋好防塵罩

  • 核查實驗記錄,補充試劑使用情況與樣本處理信息

六、注意事項

  1. 實驗期間盡量避免樣品艙打開,防止溫控系統(tǒng)紊亂

  2. PCR板應均勻加樣,避免氣泡產生或液體溢出

  3. 使用專用熒光染料,勿自行替換未驗證的染料

  4. 實驗過程中應佩戴防護手套,避免污染反應體系

  5. 所有樣本及耗材使用后應規(guī)范處置,防止污染環(huán)境

  6. 每次使用前應檢查儀器狀態(tài),出現異常及時聯系維修人員

  7. 盡量使用模板文件,提高操作一致性與數據可比性

七、常見問題與處理

問題原因分析解決措施
Ct值偏高或不一致模板濃度低、移液誤差、氣泡干擾重新提取模板,校驗加樣操作
無熒光信號熒光探針降解、通道設置錯誤更換探針,檢查軟件設置
曲線形態(tài)異常反應液污染、酶失活檢查試劑有效期與保存方式
通道干擾多重PCR染料重疊調整檢測通道設置或使用校正板
系統(tǒng)報錯軟件故障或硬件接觸不良重啟設備或聯系技術支持

八、維護與校準

1. 日常維護

  • 每次使用后進行外觀清潔

  • 保持儀器通風口暢通,防止過熱

  • 檢查電源線、USB或網絡連接狀態(tài)

2. 定期校準

  • 光學系統(tǒng)與溫控模塊應根據廠商推薦周期進行校準

  • 可使用賽默飛提供的校準板進行自檢

  • 校準應由具備資格的人員或廠家技術支持人員執(zhí)行

  • 記錄每次校準與維護結果,備查

九、安全與應急處理

  • 實驗操作遵守生物安全規(guī)定,使用生物安全柜處理高風險樣本

  • 熒光染料避免直接接觸皮膚和眼睛

  • 如遇試劑泄漏,立即使用70%乙醇或漂白劑進行清理

  • 設備發(fā)生電氣故障時,立即斷電并通知相關技術人員處理

  • 實驗過程中如發(fā)現異常升溫或煙霧,應立即停止運行并檢查電源系統(tǒng)

十、附錄:推薦PCR反應體系(以20 μL為例)

成分體積說明
2× qPCR Master Mix10 μL含酶和緩沖體系
引物(前/后)各0.4 μL最終濃度約200 nM
探針或SYBR Green0.2–0.4 μL根據染料類型選擇
模板DNA1–2 μL10–100 ng
無核酸水補足至20 μL保證總體積一致